В нашей компании синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматических ДНК/РНК-синтезаторах фирмы Applied Biosystems с использованием фосфорамидитного метода синтеза (Caruthers, M.H. (1983) Tetrahedron Lett. 24:245-248).
Олигонуклетид синтезирузется в направлении от 3′- к 5′-концу. В ходе синтеза 3′-концевой олигонуклеотид ковалентно связан с твердофазным носителем — CPG (controlled pore glass). Мономерами при синтезе служат фосфорамидиты нуклеозидов:
Синтез начинается с деблокирования нуклеозида, находящегося на 5′-конце синтезируемого олигонуклеотида, при этом с 5′-OH группы удаляется диметокситритильная (DMTr) защитная группа (стадия 1 на рис.2).
Следующая стадия — конденсация, при которой активированный фосфорамидит нуклеозида кавалентно присоединяется к свободной 5′-гидроксильной группе концевого детритилированного нуклеозида (стадия 2, рис.2). Эффективность такого присоединения около 99%. Для того, чтобы не накапливалось ошибочных олигонуклеотидов за счет оставшегося 1% непрореагировавших 5′-концевых гидроксильных групп — их блокируют («кэпируют») с помощью реакции ацетилирования. Минимальное количество молекул, которые оказались незаблокированными в процессе реакции «кэпирования» продолжают участвовать в ситнезе, и в результате после последнего цикла синтеза образуются более короткие продукты (олигонуклеотиды с пропущенными основаниями).
После реакции конденсации и «кэпирования» два концевых основания синтезируемого олигонуклеотида оказываются связанными нестабильной фосфитной триэфирной связью. Перевод ее в стабильную фосфотриэфирную связь осуществяется за счет реакции окисления (стадия 3, рис. 2), которая завершает цикл присоединения одного основания. Далее вновь следует стадия детритилирования (стадия 4, рис. 2) и цикл повторяется. После присоединения последнего основания олигонуклеотид снимается с твердой фазы и с него удаляются оставшиеся защиты, что приводит к получению целевого олигонуклеотида.
Посмотреть рис.2
Выход целевого продукта в процессе синтеза равен эффективности реакции конденсации в степени (n-1), где n-длина олигонуклеотида. Эффективность конденсации в течение реакции находится на уровне 99 — 99,5%. Таким образом, выход, к примеру, олигонуклеотида длиной 25 нуклеотидов равен 80 — 90%.
Для чего необходимо очищать синтезированный олигонуклеотид? Во-первых, как говорилось выше, в процессе синтеза из-за того, что не все молекулы «кэпируются», наряду с целевым олигонуклеотидом накапливаются более короткие продукты, содержацие делеции. Во-вторых, после удаления защитных групп с олигонуклеотида, сами защитные группы остаются как примесь. В-третьих, в неочищенном конечном продукте обязательно присутствуют существенные количества неорганических солей. Очистка с помощью гель-фильтрации (так называемое обессоливание), или с помощью переосаждения — убирает примеси защитных групп и солей, но основная проблема, из-за которой необходимо очищать олигонуклеотиды — короткие олигонуклеотидные продукты с неправильной последовательностью — этими способами не решается. Поэтому ВСЕ олигонуклеотиды, синтезируемые в нашей компании очищаются с помощью полиакриламидного гель-электрофореза и/или ВЭЖХ.
Контроль качества синтезируемых олигонуклеотидов. Существуют два критерия качества олигонуклеотидов. Первый — химическая чистота продукта (примеси более коротких олигонуклеотидов не допускаются). Контроль за этим осуществляется с помощью ВЭЖХ и электрофореза в ПААГе. Второй — точность последовательности, которую можно контролировать с помощью MALDI-TOF масс-спектрального анализа (для олигонуклеотидов длиной менее 45 оснований). Быть абсолютно уверенным в качестве олигонуклеотидов особенно важно при проведении продолжительных и сложных работ, таких как сайт-специфический мутагенез, клонирование с введением сайтов рестрикций и других.
Хранение олигонуклеотидов. Для длительного хранения или длительной транспортировки олигонуклеотиды рекомендуется лиофилизировать. В таком состоянии при температуре -20 °С олигонуклеотиды могут храниться в течении нескольких лет, при комнатной температуре — от нескольких месяцев до нескольких лет. Растворять олигонуклеотиды рекомендуется в стерильной деионизованной воде или в стерильном TE-буфере (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA).
При хранении олигонуклеотидов в растворе важным критерием длительности хранения служит их концентрация. Чем она выше — тем время хранения больше. Лучше хранить олигонуклеотиды в концентрации не ниже 50 мкМ. Время хранения олигонуклеотидов с такой концентрацией — от 6 месяцев до нескольких лет при температуре -20 °С и от одной недели до нескольких месяцев при +4°С. Другим фактором влияющим на качество хранения является частота разморозки-заморозки раствора олигонуклеотида. При частом использовании рекомендуется разаликвотить раствор и в случае, если вы, к примеру, собираетесь пользоваться одним раствором в течении нескольких дней подряд — то лучше его не замораживать, а хранить в холодильнике.
Как определить концентрацию олигонуклеотида. Сначала необходимо измерить оптическую плотность раствора олигонуклеотида, которую выражают в единицах оптической плотности (ОЕ). Зная концентрацию олигонуклеотида выраженную в ОЕ/мл можно рассчитать концентрацию, выраженную в пмоль/мкл по следующей формуле:
где NA, NC, NG, NT — количество соответствующего основания в олигонуклеотиде, OD — оптическая плотность при 260 нм, выраженная в ОЕ/мл.
Зная концентрацию олигонуклеотида в пмоль/мкл, нетрудно вычислить концентрацию в мкг/мл:
C(мкг/мкл) = С(пмоль/мкл)хMwх10-6
Молекулярную массу (Mw) олигонуклеотида можно рассчитать по формуле:
Mw = 249,2xNA + 225,2xNC + 265,2xNG + 240,2xNT + 64x([длина олига] — 1) + 2
Для выбора программы ПЦР необходимо знать температуру плавления олигонуклеотидов. Существует несколько формул, с помощью которых ее можно рассчитать. Приведем одну из таких формул: